研究内容

放射線長期被ばくと臨床的放射線耐性―その概念と機構解明

1.はじめに

放射線の細胞影響として、急性障害としての細胞死と晩発影響としての発がんが挙げられる。古典的な考え方は、放射線によってDNAに変異が起こっても修復されなければ、DNA複製を通して変異は固定される。その変異が細胞の生存に関わるならば細胞死が、生存に有利な変異ならばがん化が起こる、というものである。私たちは、トロトラスト被注入患者検体を用いて、内部被ばくによる発がんの分子機構を解析した結果、古典的な単純明快なものではなく、標的臓器内で起こる複雑な生物応答の結果発がんに至ることが明らかとなった1)(図1)。さらに複雑なことに、トロトラスト誘発がんの解析は発がん過程ばかりでなく、がん化後も引き続いて起こった長期微量被ばくによる修飾が積み重なった結果をみていることである。 放射線療法は、外科的手術や化学療法とは異なり、全身への影響が少ない上、腫瘍周囲の機能を温存することが可能である。大容量の放射線に被ばくすれば、どんな細胞でも死滅する。そのため標準的な放射線療法は分割照射による1クールが1日2Gy、5日/週総計60-80 Gyからなっている。これは、1回照射では生き残る線量であり、正常細胞が腫瘍細胞よりも放射線障害からの回復が起こりやすいという経験から割り出した照射量の長期被ばくということになる。 腫瘍が放射線療法に抵抗性の場合、耐性細胞が生き残ったのか、それとも耐性を獲得したのか。さらに、放射線治療後に再発した腫瘍は果たして放射線耐性か、より悪性度が増加しているか。正常細胞がなぜ腫瘍細胞よりも回復しやすいのか。急性の細胞死と晩発性の発がんを直接結びつけるような研究はなされてきたであろうか。すなわち、死なない程度の慢性被ばくは急性被ばくに対する反応の単なる積み重ねであろうか。 これらの疑問に答えを出すことによって、治療すべき腫瘍が通常の放射線療法に有効か否か、再発する否かが治療前に予測可能となる。そうすれば耐性細胞の出現を抑えたり、出現した耐性細胞を効率よく死滅させることも可能になる。さらに放射線療法によって誘発される二次癌の可能性も予測できる。 放射線耐性細胞のモデルの樹立と中線量慢性被ばくの細胞影響を解析は、今まで手つかずであり、放射線療法に伴う細胞の形質変化の解明につながる極めて挑戦的な研究であると考えた。

Fukumoto M, Kuwahara Y, Ohkubo Y, Wang L.: Analysis of carcinogenic mechanisms of liver cancers induced by chronic exposure to alpha-particles from internally deposited Thorotrast. Radiat Measure 41:1186-90, 2006.

2.放射線耐性細胞株の樹立

X線の発見以来、多くの研究者が安定した放射線耐性細胞株の樹立を目指してきたが、樹立は不可能であると考えられてきた。そのために、今までに解析されてきた細胞は、ある一定の放射線を照射して生き残った細胞である。従って、これらの細胞集団の中には老化様の形態を示し、分裂を停止した細胞など様々な細胞が含まれており、明らかに均一な集団ではない。また、比較している細胞株同士のゲノム背景が同一ではないという大きな問題点がある。 我々の目的は放射線療法に対する耐性と局所再発に関する分子マーカーと、放射線療法の分子標的を探索することである。単純な実験系とするため、親細胞株からゲノム背景が同一である耐性細胞の樹立を行うことにした。細胞は大線量の放射線に被ばくすれば死滅してしまうため、臨床における耐性を反映するにはどうしたら良いかを考えた。上述した標準的な放射線療法に合わせて、2 Gy/日のX線を30日間、計60 Gy以上照射しても、安定して増殖し続ける細胞を「臨床的放射線耐性」と定義し、その樹立を目標とした。細胞株として、トロトラスト症肝腫瘍の流れからヒト肝芽細胞株HepG2を用いた。しかし実験を続けて改めて放射線の不思議さに気づくとともに困難さに直面した。 2 Gy/日の照射で1月後に生残する細胞はなかった。1分割照射量を下げると、どんどん増殖する。調子に乗り、「線量を上げてもすぐには結果が出ないため、耐性細胞ができた」、と思っていたら1月ほど経ってから全滅、ということの繰り返しであった。X線を0.5 Gy/12時間なら死なないことが分かってから、6年以上照射し続けた結果、「臨床的放射線耐性」を樹立することに成功した(図2)。親株と背景ゲノム構造が同一である放射線耐性細胞株の樹立、しかも複数組みの樹立は世界的にみて存在しないが、大きく二つの疑問が出てくる。耐性細胞が親株内に元来存在し、照射によって耐性細胞の選択されたのか、獲得性に耐性となったのか。現在も毎日2 Gyを耐性形質の維持線量として照射し続けているが、それによってゲノムがズタズタになってしまい、耐性と無関係な変化が加わるため、いくら解析しても耐性に関与した分子はみつからないのでは、という疑問である。前者に対しては、再現性をもってX線2 Gyの30日間照射で親細胞株は死滅してしまうため、耐性は獲得性であることは明らかである。後者に対しては、臨床的放射線耐性細胞は、DNA二本鎖修復の効率がよいこと、アレイCGHの結果、集団としては安定な核型であることと、ある一定の細胞死が検出されることから維持照射によって一定の集団が選択維持されていると考えられる。臨床耐性細胞をヌードマウス皮下に移植して形成された腫瘍も2 Gy、30日の照射に抵抗性なため、細胞の耐性形質が腫瘍の耐性に反映されていることを明らかにした。しかし、耐性細胞由来の腫瘍組織の方が血管密度が有意に高い。通常、低酸素領域の方が耐性であることと矛盾する。放射線耐性の分子機構の解明と、放射線による主な細胞死がアポトーシスによるか否か、化学薬剤との交差耐性があるか否かについて解析中である。

Kuwahara Y, Li L, Baba T, Nakagawa H, Shimura T, Yamamoto Y, Ohkubo Y, Fukumoto M: Clinically relevant radioresistant cells efficiently repair DNA double-strand breaks induced by X-rays. Cancer Sci 100(4):747-52, 2009.

Kuwahara Y, Mori M, Oikawa T, Shimura T, Ohtake Y, Mori S, Ohkuba Y, Fukumoto M: The modified high-density survival assay is the useful tool to predict the effectiveness of fractionated radiation exposure. J Radiat Res 2010. (accepted for publication).

3.中線量長期被ばくの細胞影響

もうひとつの疑問は、死なない程度、すなわち回復可能な照量(中線量)の長期分割放射線に対する細胞の反応は短期被ばくに対する反応の単なる積み重ねか、である。さらに中線量被ばくに対して正常細胞と腫瘍細胞では反応が異なるのか、正常細胞がいつがん化に向かうのかである。上述のように、いきなりX線1日2 Gyの分割照射では細胞は全滅してしまうが、12時間ごとに0.5 Gyの分割照射では死滅しないため、この条件で31日間X線照射を行った。細胞周期の解析を行ったところ、分割照射細胞ではG1/S移行期の細胞周期制御に異常が観察され、G1サイクリンであるサイクリンD1タンパクの過剰発現と、コロニーアッセイによって放射線耐性が観察された(図3)。これらの現象は、遷移期も含めて再現性を持って観察されたうえ、31日間照射後、さらに31日間照射を休止しても不可逆的であった。サイクリンD1発現調節に関わる分子の発現や活性化分子をウエスタン法によって丹念に解析したところ、持続的なAKTの活性化とその基質であるglycogen synthase kinase-3 ? (GSK3 )の持続的な不活性化によるサイクリンD1の分解阻害によって起こっていることを明らかにした。これらの事実は分割照射による放射線療法によって、腫瘍細胞が不可逆的に放射線耐性になり得ること、そのような獲得性耐性はAKT/GSK-3 cyclinD1経路を標的とした薬剤によって克服可能なことを示唆している。実際我々の研究室では、AKT阻害剤などが培養系で耐性克服に有効であることが明らかになりつつある。今後さらに、ヌードマウスへの移植系で確認することを計画している。また、不死化2n細胞を用いて腫瘍細胞と正常細胞での応答の異同を解析する予定である。

Shimura T, Kakuda S, Ochiai Y, Nakagawa H, Kuwahara Y, Takai Y, Kobayashi J, Komatsu K, Fukumoto M: Acquired radioresistance of human tumor cells by DNA-PK/AKT/GSK3b-mediated cyclinD1 overexpression. Oncogene 2010 (accepted for publication).

4.おわりに

生物学的研究を考えてみると、我が国は欧米に引けを取らないところまで来ている。それころか、iPS細胞のようにリードしている分野もある。しかし、主な投稿先雑誌が欧米にあり、日本人の英語のハンディは明らかである。そのような状況で我が国独自の成果を出し続ける方法はあるか、どうしたら続けられるかを考えた。手法は2通りである。ほんの少ししかない材料を地道に集めるか、一見できないことを根気でカバーするしかない。世界で唯一の被ばく国である日本の研究者として、我々は放射線生物影響の研究の成果を常に世界に向けて発信し続けるべきである。安定した形質としての放射線耐性細胞株の樹立は今まで報告がなかった。何故困難なのだろうか。薬剤と異なる点は、放射線は持続的に照射しようと考えれば限りなく線量率を下げなければ細胞は死に絶えてしまうし、そのような低線量率では生物影響が現れにくい。しかし、ある程度の線量率で死なない程度の照射量では、照射時間は細胞周期のほんの瞬間に近い。すなわち、分割照射では死ぬべき細胞を殺しているだけのことで抵抗性細胞、あるいはS期のような抵抗性の相にある細胞は生き残っていることになる。もし、線量率1 Gy/分のX線を2 Gy、1回/日照射すると、細胞周期が24時間の細胞ならば、60X24/2=720日間、毎日照射すれば細胞一個は細胞周期のどの期にあっても必ず被ばくしたことになり、感受性が細胞周期のみに依存しているならば、照射開始から720日目に細胞はすべて死に絶えるはずであると概算した。山極・市川がタール癌を誘発するのに条件設定に5年、発がん法が確立してから、発がんに1年かかったのなら、もっと頑張れば良いではないか。地道に死ぬギリギリの線量を5年かければ耐性細胞が樹立できるだろうと思い立った。 今までは放射線を照射して死に易くなった細胞でどのような遺伝子が変異しているか、その遺伝子を補完することによって元の細胞と同程度の感受性に戻るかという手法は用いられていた。しかし、積極的に抵抗性を増加させる遺伝子の探索という手法は殆ど用いられてこなかった。当初、抵抗性細胞の樹立は不可能だ、そんなにX線を照射し続けたらDNAはズタズタになってしまい、何をしているのかわからなくなると皆に言われた。しかし、臨床的放射線耐性という概念を導入したことがユニークな点である。その結果、長期分割照射に対する細胞応答は、短期照射の単なる積み重ねではなく不可逆的な変化を伴う異なる反応であることが明らかとなった。さらに本研究から、遺伝子変異によって感受性の増加した細胞は照射によって除かれるために臨床的耐性細胞は集団として極めて安定であるという結論に至ったことは驚きとしか言いようがない。分割照射では各照射間にrepair、reoxygenation、repopulation、redistributionの4Rが誘導され、それらがどう寄与するかによって照射された細胞の運命が決まると考えられている4)。我々の研究から、もうひとつのR、resistanceを加える必要があることも明らかとなった。今後、放射線の急性影響である細胞死と晩発影響である発がんが結びつくはずである。これらの研究を通して私たちは、積極的に治療に関わる、治療放射線生物学を目指している。

注)第二次世界大戦中に使用された血管造影剤で自然α線源であるトロトラストは、注入後、主に肝臓に沈着し、生物学的半減期は400年と言われている。肝は生涯にわたってα線被ばくを受けるため、投与されてから数十年して肝に悪性腫瘍が発生した。肝腫瘍として、肝内胆管癌と血管肉腫が特徴的である。解剖例は、沈着量や被ばく量など詳細なデータが揃っているため、ヒトにおける放射線内部被ばくによる発がん機構を解明するために不可欠である。

トロトラスト症: 放射線発がん機構解明の温故知新

トロトラスト症病理資・試料に関するデータベース

今後、放射性廃棄物の管理に伴う事故やテロも想定されるため、長期微量放射線による内部被ばくの人体 への影響、特に発がん研究は重要である。しかし、内部被ばくは、核種によって体内分布(標的臓器)が異 なり、線量評価が困難なため、外部被ばくに比べて研究は進んでいない。自然α放射線源である二酸化トリ ウムのコロイド溶液、トロトラストは、第二次世界大戦中血管造影剤として使用されたが、投与されると過 半は肝臓に沈着し、持続的にα線に被ばくするため、数十年して肝腫瘍を発症する。原発性肝がんは、肝細 胞癌(HCC)が圧倒的に多いが、トロトラスト症では肝内胆管癌(ICC)と血管肉腫(AS)がほぼ同等に発症する ため、これらを解析することは、低線量持続的被ばくによって起こる、ヒト放射線発がん機構の解明にとっ て不可欠である。古典的な放射線発がん機構の考え方は、放射線によって起きたDNA傷害が細胞の生存に 重要な遺伝子の場合は細胞死が、誤って修復されればがんが起こる、である。今日、放射線影響に新たな考 え方が加わっている。一つは、放射線によって細胞に遺伝子変異が起こり易くなるという、ゲノム不安定性 の獲得、もう一つは、ある細胞が直接被ばくしていなくても、周囲の細胞が被ばくすれば、被ばくしたと同 様な放射線影響を受ける、バイスタンダー効果である。それらがヒトの放射線発がんに当てはまるかについ ての解答は出ていない。我々はトロトラスト症肝腫瘍を丹念に解析することによって、放射線発がん機構を 解明することを目指している。国際規制物質のトリウムによる実験はほぼ不可能であるため、検討対象は 15年以上前に解剖された病理標本に限られる。マイクロサテライト(MS)はゲノム上ほぼ均一に存在する繰 り返し配列であり、特定MSの両端に特異的なPCRのプライマーを設定することによって、癌抑制遺伝子の 不活性化であるヘテロ接合性の消失(LOH)と、ミスマッチ修復傷害の結果起こるMS不安定性(MSI)を検 出できる。MSの解析から、肝胆道系の発がんに関わる遺伝子変異は、発がん要因よりもがんの発生母地と なる細胞に特異的であり、トロトラスト症ICCは肝細胞と胆管上皮の両方へ分化しうる幹細胞由来であるこ とを明らかにした。MSIはトロトラスト症ICCで高頻度でみられ、ミスマッチ修復分子のひとつ、hMLH1 遺伝子のプロモーターのメチル化による不活性化が関与していることを明らかにした。また、非がん部にも LOHやMSIのみられる症例があり、トロトラスト症ではゲノム不安定性が肝全般に起こっていることを明ら かにした。イメージングプレートを用いて病理切片一枚から肝全体のトリウム沈着量の推定も可能とした。 トロトラストはマクロファージに貪食されて肝内を循環しているため、α線の飛程は短いものの、肝全体が 被ばくしていることが明らかとなった。また、マクロファージは集簇し、門脈域ばかりでなく類洞内にも観 察され、その周囲の実質細胞の変性と線維化も著明であった。この事実は類洞内皮がα線被ばくの直接の標 的であることを示唆している。網羅的LOH解析から、LOH頻度はトロトラスト症ASで高く、大きい染色体 でしかも、短腕よりも長腕に高い傾向がみられた。ASではα線による直接DNA傷害が起こっている可能性 が高い。トロトラスト症ICCとASにおいて、潜伏期間、集積線量ともに有意差を認めなかったが、両者で 高頻度LOHのローカスの分布は異なっていた。これは、両者で発がんに必要な遺伝子変異の数は等しい が、発がんの標的細胞によって変異を受ける遺伝子が異なることを示している。さらに、染色体8qと13qに 放射線発がんに共通した癌抑制遺伝子が存在する可能性があり、解析中である。 以上から、放射線発がんは、従来考えられていたように放射線によるDNAの傷害・修復異常による遺伝 子変異の固定という単純な機構ではなく、被ばく組織の改変や炎症など、生体側の反応が発がんに関与して いることを明らかにした。

福本 学,桑原義和:放射線被ばくによる肝発がん:トロトラスト症発がん機構解明の温故知新.日本臨床.67(増刊3):156-60, 2009.

放射線被ばく特異的DNA傷害の検出

ミトコンドリアDNAは細胞一個当たり数百~数千コピー存在し、核DNAに比べて保護・修復機構が弱い ため、活性酸素種や加齢に伴って、特定の欠失(common deletion)が起こり、蓄積することが知られてい る。培養細胞で検討したところ、CDはX線照射によって誘発されるが、CDを生じた細胞は細胞死によって 排除されることが明らかとなった。さらに、放射線被ばくに特異的に誘発される新規欠失を見出した。この 欠失は極めて鋭敏であるため、細胞が放射線被ばくしたことの指標になると考えられる。

Wang L, Kuwahara Y, Li L, Baba T, Shin RW, Ohkubo Y, Ono K, Fukumoto M . Analysis of Common Deletion (CD) and a novel deletion of mitochondrial DNA induced by ionizing radiation. Int J Radiat Biol 83:433-42, 2007.

宇宙病理学

将来、ヒトは宇宙へ飛び出し、そこで生活するようになる。宇宙飛行したラットを用いて肝機能の変化を 検討するとともに、重力と放射線の影響を地上実験によって検証している。

Baba T, Nishimura M, Kuwahara Y, Ueda N, Naitoh S, Kume M, Yamamoto Y, Fujita J, Funae Y, Fukumoto M: Analysis of gene and protein expression of cytochrome P450 and stress-associated molecules in rat liver after spaceflight. Pathol Int 58(9):589-95, 2008.

今後の方向: 放射線耐性細胞株の樹立と解析

腫瘍の放射線療法は機能温存の面で優れているため、手術適応のない症例や補助療法として重要であり、 その適応は拡大している。放射線治療後の予後を決定する大きな因子である、再発の可能性が治療前に予測 できれば画期的である。さらに、多門照射や強度変調法など技術革新は、かえって病巣周囲の正常組織の線 量増加による晩発性障害や、二次癌発症の可能性などの問題も浮上させている。これらの問題を解決するた めに、我々は、放射線耐性と局所再発に関する分子マーカーと、放射線療法の分子標的を探索することを最 終目標として、ヒトHepG2細胞株にX線を0.5 Gy/12時間、5年以上照射し続け、4種類の長期放射線被ばく亜 細胞株を樹立した。これらのうち、1亜株は安定して放射線耐性を示している。このように、親株と背景ゲ ノム構造が同一である放射線耐性細胞株の樹立は世界的にみて存在しない。現在、長期照射株を用いて、放 射線耐性の分子機構の解明と科学薬剤との交差耐性について解析中である。

参考

インタビュー第25回:放射線と癌の関係を探る- 研究最前線 - 東北大学加齢医学研究所

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