研究内容

生き物のからだを作っている全ての種類の細胞の元となり、さらに複雑な形態形成へと繋がる生殖細胞の不思議な能力が、どのようなメカニズムによって制御されているのかに興味を持って研究を進めています。

哺乳動物では胎仔(胚)発生の初期段階で、まず分化万能性をもつ多能性幹細胞が形成され、そこから生殖細胞を含む、さまざまな細胞が分化します。からだを構成する体細胞の場合には、分化後さまざまな機能を果たす細胞として役割を全うしたのち細胞死を起こしますが、生殖細胞だけは精子と卵子へ分化し、それらが受精することにより再び個体発生全能性を持つ受精卵に戻るという性質を持っています。生殖細胞が分化し、卵子や精子が形成される過程では、核の中の遺伝子の働き方の制御に深く関わっているエピジェネティックな状態や、細胞のさまざまな生理機能に直結する代謝状態が、体細胞では起こさないような変化をしていることが明らかになり、このような変化が生殖細胞の不思議な性質と深く関わっていると考えられています。

また細胞の分化は、普通は後戻りすることはありませんが、分化途中にある生殖細胞は、いくつかの増殖因子とともに培養すると、短時間で多能性幹細胞へ戻ることが明らかになっています。このことから生殖細胞と多能性幹細胞は性質が異なっていますが、容易に相互変換できる関係にあると考えられます。また生殖細胞以外の分化細胞でも、細胞分化多能性の鍵となる転写因子などを強制的に発現させることでiPS細胞へと変化することがわかっており、分化細胞が多能性幹細胞へ後戻りする再プログラム化のメカニズムには、共通した原理があるように思えます。

このような生殖細胞や多能性幹細胞に関係した研究によって、私たちのからだの成り立ちを最初にコントロールしている根本原理を解明し、またそれによって不妊や先天性異常の原因解明や治療、さらに再生医療に役立てたり、また有用な生き物や希少な生き物を増やしたり保存したりする新しいテクノロジーを作り出せるのではないかと考えています。

図1 生殖細胞と多能性幹細胞の関係

具体的には次に挙げるようなテーマで研究を行っています。

私たちは最近の研究により、胎仔期の未分化な生殖細胞の始原生殖細胞(PGC)では、代謝状態が多能性幹細胞や体細胞とは大きく異なっていることを明らかにしました。また胎仔期生殖細胞が培養下や胚の中で多能性幹細胞へ再プログラム化される分子機構や、多能性幹細胞および体細胞が生殖細胞特異的遺伝子の発現を抑制している分子機構を見いだしました。さらに癌細胞と精巣生殖細胞で特異的に発現する遺伝子の制御機構を示しました。その内容を以下に説明します。


1 胎仔生殖細胞のがん化を抑制するの作用機構

胎仔精巣内の未分化な生殖細胞が、特定の遺伝子変異などにより多能性幹細胞へ変化し、それが、さまざまな組織細胞に無秩序に分化することにより、奇形腫という腫瘍が形成されます。そして、この奇形腫発症の原因の1つとして Dnd1遺伝子の変異が知られています。この研究ではDnd遺伝子変異がもたらすヒストン修飾の異常により起こる、細胞周期を促進する遺伝子の発現上昇が、奇形腫発症につながることを示しました。

まずDnd1変異マウス精巣で生殖細胞から変化した多能性幹細胞(初期奇形腫細胞)では、遺伝子発現を抑制する働きがあるヒストンH3K2のメチル化(H3K27me3) と、その責任酵素のEzh2の発現低下が見られることを明らにしました。一方、Dnd1がEzh2 mRNAに結合することにより、その発現を保つことを示しました。さらにEzh2 によるH3K27me3標的遺伝子候補として、奇形腫形成に関与することが報告されている、細胞周期を促進するサイクリンD1遺伝子(Ccnd1)を同定し、Dnd1変異精巣の初期奇形腫細胞で、 Ccnd1の発現上昇が起こることを明らかにしました。これらの結果から、Dnd1の機能欠損により起こるEzhの発現低下を介したH3K27me3の低下がCcndの発現上昇を引き起こし、それが奇形腫形成の原因の1つとして働いている可能性が示されました。

Gu, W., Mochizuki, K., Otsuka, K., Hamada, R., Takehara, A., Matsui, Y. Dnd1-mediated epigenetic control of teratoma formation in mouse. Biology Open 7, bio030106 (2018).

図2 Dnd1による奇形腫形成の抑制機構

A : Dnd1はEzh2の発現を保つ働きをし、それによりCcnd1遺伝子のヒストンH3K27メチル化が保たれ、その発現が抑制される。

B: Ccnd1の発現抑制により、胎仔生殖細胞の多能性幹細胞への変化が起こらなくなり、奇形腫形成が抑制される。

C: 胎仔生殖細胞(緑)でのヒストンH3K27メチル化(赤)。紫は核を示す。

2 始原生殖細胞のユニークな細胞内代謝状態とその役割

細胞の代謝状態は、細胞機能の制御に重要と考えられますが、生殖細胞の代謝状態が分化の過程で、どのように変化し、それが生殖細胞の性質にどのような影響を与えるかは分かっていませんでした。わたしたちは、これらを次のような実験により明らかにしました。 まず生殖細胞特異的に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックマウスを用い、GFP陽性の生殖細胞とGFP陰性の生殖巣体細胞を精製しました。次にそれらを使った網羅的な代謝化合物解析(メタボローム解析)、タンパク質解析(プロテオーム解析)を行い、生殖細胞では多能性幹細胞と比較して、アミノ酸と核酸の合成経路が亢進していること、さらに解糖系の抑制と、ミトコンドリアで効率よくエネルギーを産生する酸化的リン酸化の亢進が起こっていることを見出しました。また胎仔生殖巣の体細胞と比較しても、酸化的リン酸化が亢進していることがわかりました。  また様々な胎齢由来の胎仔生殖細胞のエネルギー代謝活性を測定し、胚発生の進行に伴う生殖細胞の分化過程で、解糖系活性の低下と、酸化的リン酸化活性の上昇が、逐次的に起こることがわかりました。さらに培養系に阻害剤を添加することで酸化的リン酸化を阻害すると、生殖細胞の形成と生存が顕著に抑制されることを明らかにしました。また同様に解糖系を阻害した場合は、胎仔生殖細胞の多能性幹細胞への再プログラム化が阻害され、また生殖細胞の形成も影響を受けることがわかりました。 これらの研究成果から、胎仔生殖細胞では核酸とタンパク質の生合成が亢進している可能性が示唆され、さらにミトコンドリアのエネルギー産生経路が生殖細胞の形成と維持に必須であることが明らかになり、こういった代謝の特徴が、次世代個体を担う精子・卵子に分化する上で重要な役割を果たしている可能性が示されました。今後、エネルギー代謝経路の変化に関わる遺伝子を同定し、その変異が引き起こす配偶子形成異常を調べることなどにより、生殖細胞における代謝異常と不妊や先天性異常との関連を解明することが期待できます。

Yohei Hayashi, Kei Otsuka, Masayuki Ebina, Kaori Igarashi, Asuka Takehara, Mitsuyo Matsumoto, Akio Kanai, Kazuhiko Igarashi, Tomoyoshi Soga, and Yasuhisa
Matsui. Distinct requirements for energy metabolism in mouse primordial germ cells and their reprogramming to embryonic germ cells. Proceedings of National Academy of Science, USA. 114, 8286-8294 (2017) doi/10.1073/pnas.1620915114

図3  始原生殖細胞のエネルギー代謝活性の特徴 始原生殖細胞では、多能性幹細胞から分化する過程で、解糖系が抑制される一方で、酸化的リン酸化の活性化がおこる。こういったエネルギー代謝経路の変化が、始原生殖細胞の形成・生存・分化に重要であると考えられる。

3 DNAメチル化による、がん精巣抗原遺伝子Fthl17の発現制御機構

 生殖細胞と、がん細胞で共通して発現が認められ、他の正常組織では発現が低い、がん精巣抗原(cancer/testis antigen; CTA)遺伝子の、生殖細胞と、がん細胞における発現制御機構の相違を明らかにする目的で、 CTA遺伝子の1つ、Fthl17 (Ferritin, heavy chain like 17)に着目し、DNAメチル化を中心とした発現制御機構解析を行った。まずFthl17 は、正常組織と比較して肺がん細胞では中程度の発現を、また精巣内で精子を形成する元となる精原幹(Germline stem; GS)細胞では高いレベルで発現していることを確認した。次にバイサルファイト・シークエンス法とメチル化レポーターアッセイにより、肺がん細胞、GS細胞では、ともに遺伝子上流領域のDNA低メチル化が発現誘導を引き起こしていることを明らかにした。さらに、これらの細胞では、転写開始点直近の隣り合った異なる領域の DNAメチル化状態に違いがあり、それぞれの細胞での発現レベルを制御している可能性が示唆された。

Aoki, N., Mochizuki, K., Matsui, Y.DNA Methylation of the Fthl17 5’-Upstream Region Regulates Differential Fthl17 Expression in Lung Cancer Cells and Germline Stem Cells.  PLoS ONE12, e0172219 (2017).

図4  正常組織と比較して、がん細胞では、遺伝子上流領域の-0.6~-0.3 kbの部分の低メチル化状態が中程度の発現を、また精原幹細胞では-0.3~0 kbの部分の低メチル化状態が高レベルの発現を引き起こすことがわかった。

4 体細胞を生殖細胞に近づける試み

生殖細胞は受精を経て次世代個体を生み出すという個体発生全能性をもっていますが、体細胞にそのような性質はありません。このような性質の違いがどのように生みだされるのか、また、どのように制御されているのかを明らかにするため、わたしたちは、培養下で体細胞から生殖細胞を直接誘導し、そのメカニズムを解明することを考えました。 体細胞から生殖細胞を直接誘導する戦略として、体細胞では発現しておらず生殖細胞で発現している、多能性関連遺伝子と生殖細胞特異的遺伝子を同時に発現誘導することを考えました。具体的には、多能性関連遺伝子の発現誘導には、山中4因子発現プラスミド(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)の導入を行いました。また生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導を行うために、生殖細胞では遺伝子の発現に対して促進的なエピゲノム状態が多く見られることに注目し、その状態に近づけるために、RNA干渉法によるDNAのメチル化酵素遺伝子の発現阻害と、低分子化合物によるH3K27 tri-methylation(H3K27me3)を含む複数の抑制的ヒストン修飾の阻害、および細胞分化を促進する働きのある因子であるTGF-βの阻害を組み合わせる処理を行いました。その結果、発現レベルは低いながらマウス胎仔線維芽細胞(MEF)において、生殖細胞特異的遺伝子群を発現誘導することに成功しました。また体細胞性遺伝子の発現は誘導されていなかったことから、生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導は非特異的な転写活性化によるものではないと考えられます。一方、神経系特異的遺伝子など、いくつかの組織特異的遺伝子の発現誘導も、同時に見られることがわかりました。以上の結果は、MEFでは生殖細胞特異的遺伝子を含む組織特異的遺伝子の発現は、DNAメチル化やヒストンH3K27me3を含むヒストン修飾などによるエピジェネティック制御を介して抑制されていることを示唆しています。

Sekinaka,T., Hayashi, Y., Noce, T., Niwa, H., Matsui, Y. Selective de-repression of germ cell-specific genes in mouse embryonic fibroblasts in a permissive epigenetic environment. Scientific Reports 6:32932 (2016). DOI: 10.1038/srep32932

図5 培養下で体細胞の遺伝子発現パターンを生殖細胞に近づける手法 抑制的ヒストン修飾などを阻害する低分子化合物とともに、DNAメチル化酵素の発現を低下させることのできるRNA干渉法を使って、マウス胎仔線維芽細胞を数日間、培養することより、遺伝子発現パターンを生殖細胞に近づけることに成功しました。赤色で示されている細胞が生殖細胞へ近づいた細胞(生殖細胞マーカーであるDazl陽性細胞)です。また、青色は細胞の核(DAPIによる染色)を示しています。

5 多能性幹細胞を始原生殖細胞へ直接変換させる分子機構

多能性幹細胞は、通常は外胚葉性の細胞に変化したのち、そのごく一部が始原生殖細胞に分化しますが、生殖細胞と多能性幹細胞は共通した遺伝子発現などの性質を共有し、直接的に生殖細胞へ変化する可能性が考えられます。

私たちは、未分化状態で維持されているES細胞で、転写制御因子Maxの発現を低下させると、生殖細胞特異的遺伝子の発現が全ゲノム的に上昇することを見いだしました。またMaxはES細胞においてヒストンH3K9メチル化酵素のG9a, GLPと複合体を作り、さらに生殖細胞特異的遺伝子のプロモーター領域に結合することで、H3K9メチル化を介してそれら遺伝子の発現を抑制することがわかりました。この結果から、多能性幹細胞ではH3K9のメチル化が、始原生殖細胞へ変化することを押しとどめているバリアとして働いていて、このバリアが解除されることが、多能性幹細胞が始原生殖細胞へ変化するためのスイッチの一つとして働いている可能性が考えられます。

図6 Maxのノックダウンにより始原生殖細胞特異的遺伝子を発現するようになったES細胞。緑が始原生殖細胞特異的なVasa-Venusレポーター遺伝子の発現を示す。また赤はH3K9のメチル化を示し、Vasa-Venus陽性細胞では低メチル化になっていることがわかる。青は細胞核を示す。

(Maeda et al., Max is a repressor of germ-cell-related gene expression in mouse embryonic stem cells. Nature Communications 4,1754, 2013, doi: 10.1038/ncomms2780.)


大学院の紹介

私たちの研究室は、大学院生命科学研究科分化再生制御分野(http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/research/celldifferentiation/)、および医学系研究科の講座(http://www.med.tohoku.ac.jp/org/cooperate/127/index.html)にもなっていて、大学院生として研究に参加できます。


最近の発表論文

  1. Gu, W., Mochizuki, K., Otsuka, K., Hamada, R.,Takehara, A., Matsui, Y. Dnd1-mediated epigenetic control of teratoma formation in mouse. Biology Open 7, bio030106 (2018). PMID: 29378702
  2. Yohei Hayashi, Kei Otsuka, Masayuki Ebina, Kaori Igarashi, Asuka Takehara, Mitsuyo Matsumoto, Akio Kanai, Kazuhiko Igarashi, Tomoyoshi Soga, and Yasuhisa Matsui. Distinct requirements for energy metabolism in mouse primordial germ cells and their reprogramming to embryonic germ cells. Proceedings of National Academy of Science, USA. 114, 8286-8294 (2017) doi/10.1073/pnas.1620915114 PMID: 28716939
  3. Aoki, N., Mochizuki, K., Matsui, Y. DNA Methylation of the Fthl17 5’-Upstream Region Regulates Differential Fthl17 Expression in Lung Cancer Cells and Germline Stem Cells. PLoS ONE 12, e0172219 (2017). PMID: 28207785
  4. Sekinaka,T., Hayashi, Y., Noce, T., Niwa, H., Matsui, Y. Selective de-repression of germ cell-specific genes in mouse embryonic fibroblasts in a permissive epigenetic environment. Scientific Reports 6:32932 (2016). DOI: 10.1038/srep32932 PMID: 27608931
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