研究内容

生き物のからだを作っている全ての種類の細胞の元となり、さらに複雑な形態形成へと繋がる生殖細胞の不思議な能力が、どのようなメカニズムによって制御されているのかに興味を持って研究を進めています。

哺乳動物では胎仔（胚）発生の初期段階で、まず分化万能性をもつ多能性幹細胞が形成され、そこから生殖細胞を含む、さまざまな細胞が分化します。からだを構成する体細胞の場合には、分化後さまざまな機能を果たす細胞として役割を全うしたのち細胞死を起こしますが、生殖細胞だけは精子と卵子へ分化し、それらが受精することにより再び個体発生全能性を持つ受精卵に戻るという性質を持っています。生殖細胞が分化し、卵子や精子が形成される過程では、核の中の遺伝子の働き方の制御に深く関わっているエピジェネティックな状態や、細胞のさまざまな生理機能に直結する代謝状態が、体細胞では起こさないような変化をしていることが明らかになり、このような変化が生殖細胞の不思議な性質と深く関わっていると考えられています。

また細胞の分化は、普通は後戻りすることはありませんが、分化途中にある生殖細胞は、いくつかの増殖因子とともに培養すると、短時間で多能性幹細胞へ戻ることが明らかになっています。このことから生殖細胞と多能性幹細胞は性質が異なっていますが、容易に相互変換できる関係にあると考えられます。また生殖細胞以外の分化細胞でも、細胞分化多能性の鍵となる転写因子などを強制的に発現させることでiPS細胞へと変化することがわかっており、分化細胞が多能性幹細胞へ後戻りする再プログラム化のメカニズムには、共通した原理があるように思えます。

このような生殖細胞や多能性幹細胞に関係した研究によって、私たちのからだの成り立ちを最初にコントロールしている根本原理を解明し、またそれによって不妊や先天性異常の原因解明や治療、さらに再生医療に役立てたり、また有用な生き物や希少な生き物を増やしたり保存したりする新しいテクノロジーを作り出せるのではないかと考えています。

図１　生殖細胞と多能性幹細胞の関係

具体的には次に挙げるようなテーマで研究を行っています。

私たちは最近の研究により、胎仔期の未分化な生殖細胞の始原生殖細胞(PGC)では、代謝状態が多能性幹細胞や体細胞とは大きく異なっていることを明らかにしました。また胎仔期生殖細胞が培養下や胚の中で多能性幹細胞へ再プログラム化される分子機構や、多能性幹細胞および体細胞が生殖細胞特異的遺伝子の発現を抑制している分子機構を見いだしました。さらに癌細胞と精巣生殖細胞で特異的に発現する遺伝子の制御機構を示しました。その内容を以下に説明します。

1　妊娠期の化学物質摂取が子孫の精子形成異常を引き起こすしくみ

現代社会において、精子数の減少が男性不妊の一因である可能性が日本を含めた多くの先進国で指摘されています。動物実験により、内分泌攪乱物質を含む、いくつかの化学物質が精子形成に影響する可能性が示されていますが、因果関係や精子形成不全が起こるしくみについては不明な点が多く残されています。妊娠期のマウスに、プラスチックの可塑剤として広く使われてきたフタル酸ジエチルヘキシル(DEHP)を投与すると、産仔の成長後に精子形成の異常が確認され、さらに孫、曾孫世代まで同様の異常が見られることが報告されています。今回の研究ではDEHPによる子孫の精子形成異常の原因として遺伝子の発現制御に重要なDNAメチル化の異常の関与を調べました。母胎にDEHPまたは対象としてコーンオイルを投与した胎仔由来の生殖細胞、および生後の精巣内の生殖細胞について、DNAのメチル化を全ゲノム的に調べたところ、精子形成に必須な複数の遺伝子が、DEHP投与により高メチル化に変化しており、そのいくつかは胎仔期生殖細胞から生後の精巣の精子幹細胞（精原細胞）で一貫して高メチル化状態を保っていることがわかりました。それらの遺伝子について、精原細胞での発現を調べたところ、精子形成に必須な３種類の遺伝子(Hist1h2ba, Sycp1, Taf7l)の発現が、母胎DEHP投与により低下していることがわかりました。さらに培養細胞を使った実験でも、これらの遺伝子にDNAメチル化を起こすことで、その発現が低下することを確認しました。これらの結果から、母胎DEHP投与が胎仔生殖細胞で精子形成に必要な遺伝子のDNAメチル化を誘導し、それらの発現が阻害されることで、精子形成の異常が起こることが示唆されます。
Tando, Y., Hiura, H., Takehara, A., Ito-Matsuoka, Y., Arima, T., Matsui, Y. Epi-mutations for spermatogenic defects by maternal exposure to Di (2-ethylhexyl) phthalate. eLife 10, e70322, 2021

図１　DEHPの母胎投与が産仔の精子形成を阻害するしくみ

妊娠期マウスにDEHPを投与すると、産仔での精子形成が阻害される（左）。DEHPにより、胎仔生殖細胞で本来は低メチル化状態である精子形成に必要な遺伝子のDNAメチル化が誘導され、それが生後の精巣内の精原細胞でも保たれて遺伝子の発現低下と精子形成の阻害が起こる（右）。

2　卵母細胞の発育におけるピルビン酸のミトコンドリアへの取込の役割

私たちは、これまでにマウス胎仔生殖細胞のメタボローム・プロテオームの統合解析を行い、胎仔生殖細胞が、生殖巣の体細胞や多能性幹細胞と比較して、高いミトコンドリア代謝などの特徴的な代謝状態にあることを明らかにしてきました。その知見をもとに今回の研究では、胎仔生殖細胞で亢進しているミトコンドリア代謝の、胎仔生殖細胞から卵母細胞が形成される際の役割と作用機構の一端を明らかにしました。マウス胎仔卵巣の器官培養系に、ピルビン酸のミトコンドリアへの取込みを担うMPCタンパク質の阻害剤を添加すると卵胞形成の初期段階が抑制され、さらにミトコンドリア代謝の中間代謝産物で、DNAやヒストンの脱メチル化の制御に関与するαケトグルタル酸およびコハク酸が、阻害剤の影響を緩和することがわかりました。また卵母細胞で発現し、卵母細胞を取り巻く顆粒膜細胞の増殖に必要な分泌性因子GDF9の遺伝子発現が阻害剤により低下し、GDF9が阻害剤の影響を緩和することが明らかになりました。さらにMpc2の欠損マウスでも、同様な初期卵胞発達の抑制が確認されました。これらの結果から、ピルビン酸のミトコンドリアへの効率の良い取込みを介して、トリカルボン酸(TCA)回路のαケトグルタル酸などが十分に確保されることによりGDF9の発現が保たれ、それにより卵胞形成が円滑に進行すると考えらます。
Tanaka, K., Hayashi, Y., Takehara, A., Ito-Matsuoka, Y., Tachibana, M., Yaegashi, N., Matsui, Y. Abnormal early folliculogenesis due to impeded pyruvate metabolism in mouse oocytes. Biology of Reproduction 105, 64-75 (2021).

図１　卵胞発達におけるピルビン酸代謝の作用機構
卵母細胞で、ミトコンドリアへのピルビン酸の取込みにより回路のαケトグルタル酸などの中間代謝産物が充分量確保される。それにより増殖因子GDF9の発現が保たれ、卵母細胞の成熟に必要な顆粒膜細胞の発達が促進される。

3　胎仔期生殖細胞の雌雄と発生段階に特徴的な代謝状態の変化

私たちは2017年のPNASに発表した論文で、メタボローム・プロテオーム解析により、マウス13.5日胚の雄の始原生殖細胞では、ES細胞や周囲の体細胞と比較して酸化的リン酸化が顕著に亢進しているなどの、特徴的な代謝状態になっていることを報告しました。今回、この研究をさらに発展させ、13.5日胚および18.5日胚の雌雄生殖細胞について同様の解析を行い、雌雄と発生段階に応じた代謝と特定の細胞機能に関連した経路の特徴的な変化を明らかにしました。 2017年の研究と同様に、生殖細胞特異的に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用い生殖細胞と生殖巣体細胞を精製し、網羅的な代謝化合物解析（メタボローム解析）、タンパク質解析（プロテオーム解析）を行いました。その結果、例えば、酸化的リン酸化(OXPHOS)や、タンパク質の安定性に関連する分子経路は、13.5日胚では、雌に比べて雄で亢進していますが、発生の進行に伴い雄では低下、雌では上昇し、18.5日胚では雌の方が雄より亢進していることがわかりました。また、エピジェネティック制御、アミノ酸や核酸合成などへの関与が大きい、One-Carbon経路やトリカルボン酸（TCA）回路関連の代謝経路は、発生段階を問わず雌より雄で亢進していることがわかりました。これらの結果から、胎仔期生殖細胞の代謝状態が、様々な細胞の制御機構と関連しながら、配偶子への分化に重要な役割を果たしている可能性が示唆されました。
Hayashi, Y., Mori, M, Igarashi, K., Tanaka, K., Takehara, A., Ito-Matsuoka, Y., Kanai, A., Yaegashi, N., Soga, T., and Matsui, Y. Proteomic and metabolomic analyses uncover sex-specific regulatory pathways in mouse fetal germline differentiation. Biology of Reproduction 103, 717-735 (2020).

図1　雌雄と発生段階でダイナミックに変化する生殖細胞の代謝状態 13.5日胚 (E13.5)の雌(f)雄(m)始原生殖細胞(PGC)と、18.5日胚 (E18.5)の雌雄生殖細胞(GC)の、メタボローム・プロテオームの統合解析の結果を模式的に示しています。色が濃いほど量が多いことを表します。

4　精子とがん細胞の意外な接点‐がん・精巣抗原タンパク質TEKT5による精子形成とがん増殖の制御機構-

がん・精巣抗原(CTA)は、ヒトがん細胞と精巣で、共通して特異的に発現するタンパク質として同定され、これまでに270種類あまりのヒトCTA遺伝子が同定されています。そのうちのいくつかは、がん細胞または精巣生殖細胞での機能が示されていますが、多くのCTAの機能は不明のままです。特に、生殖細胞とがん細胞の両者で機能するCTAは知られていません。そこで、生殖細胞での機能解析が容易なマウスを対象とし、ヒトCTA遺伝子のマウスホモログ遺伝子を同定し、さらにそれらのがん細胞の増殖・生存における役割の解析を、マウスがん細胞株でのRNA干渉によるノックダウン実験により行いました。その結果、調べた84種類のCTA遺伝子のうち47遺伝子が、がん細胞の増殖・生存に関わることを見いだしました。さらにその中の一つ、TEKT5タンパク質が、チューブリンタンパク質の重合によりできる細胞骨格を形成する微小管の構造を、チューブリンのアセチル化の維持を介して保つ働きがあること、さらに微小管を維持することにより、細胞周期を抑制するシグナル分子SMAD3の細胞核への移行を阻害し、がん細胞の増殖・生存を維持する働きがあることを明らかにしました。さらに、精巣でのノックダウン実験により、チューブリンタンパク質の維持を介して精子形成の最終段階で働くことを明らかにしました。これらの結果から、一つのCTAタンパク質が接点のある分子機構を介して、生殖細胞とがん細胞の両者で、異なる役割を果たしていることがわかりました。
Aoki, N., Matsui, Y. Comprehensive analysis of mouse CTA functions in cancer cells and roles of TEKT5 in cancer cells and testicular germ cells. Molecular and Cellular Biology, 39, e00154-19 (2019). (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31208979)

図1 TEKT5の作用機構
A. CTAの一つであるTEKT5をノックダウンすると(Tekt5 KD)、チューブリン（赤）が断片化する。青はDAPIによる核染色を示す。
B. TEKT5は、微小管チューブリンの脱重合を阻害することにより、がん細胞の細胞周期を抑制するシグナルを阻害することで増殖・生存を促進し、また精子形成の最終段階で必須な機能を果たす。

5　シグナル伝達分子AKTによる、細胞周期とエピジェネティック制御を介した、始原生殖細胞の再プログラム化機構

始原生殖細胞(PGC)の、多能性幹細胞（EG細胞）への再プログラム化は、細胞外から作用するLIFやbFGFなどのサイトカインにより誘導されます。そしてこれまでの研究から、細胞内シグナル伝達を担うAKTタンパク質の活性化が、PGC内でそれらサイトカインシグナルを伝達する働きがあることがわかっています。しかしAKTの下流で、再プログラム化を誘導するしくみは十分に理解されていません。今回の研究で、私たちはAKT活性化によるシグナル伝達が、細胞周期のG1期を抑制するp27kip1の発現を低下させ細胞周期を促進すること、またPGCの再プログラム化を抑制することがこれまでに明らかになっているヒストンH3リジン27のメチル化を、その責任酵素EZH2を抑制することで低下させる働きがあることを示しました。これらの結果から、PGCの再プログラム化が、AKTの活性化が引き起こす細胞周期の促進と、ヒストンメチル化の低下により誘導されることが明らかになりました。
Takehara, A., Matsui, Y. Shortened G1 phase of cell cycle and decreased histone H3K27 methylation are associated with AKT-induced enhancement of primordial germ cell reprogramming. Development Growth and Differentiation, 61, 357-364 (2019). doi: 10.1111/dgd.12621. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31199000)

図1
A. AKTを活性化すると（緑色）、p27kip1の発現（赤色）が低下する。
B. AKTの活性化は、p27kip1の発現抑制を介した細胞周期の促進と、EZH2の抑制を介したヒストンH3K27メチル化の低下により、PGCの再プログラム化を促進する。

6　生殖細胞特異的なマイクロRNAによる精子形成の制御機構

精巣には精子に分化する幹細胞（精原幹細胞）が存在し、それが自己複製的に増えながら一部が精子へ分化するため、個体の一生を通じて精子形成が起こります。今回の研究で、生殖細胞でのみ発現しているマイクロRNA(XmiR)を同定し、それが幹細胞の増殖と分化のバランスの維持に働いている可能性がわかりました。マイクロRNAはタンパク質をコードしていない短いRNAで、多くの種類が同定されており、それぞれ特定のmRNAに作用し、その安定性や翻訳を抑制する働きがあることがわかっています。今回の研究で同定したXmiRは、精原幹細胞の増殖を促進し、同時に減数分裂の進行を抑制するWNT/βカテニン・シグナル因子の一つであるFzd4のmRNAを標的とし、その発現を抑制することにより、精原幹細胞の増殖を抑制し減数分裂は促進する働きがあることがわかりました。こういったXmiRの働きにより、安定した精子形成が保障されていると考えられます。
Ota, H., Ito-Matsuoka, Y., Matsui, Y. Identification of the X-linked germ cell specific miRNAs (XmiRs) and their functions. PLoS ONE 14, e0211739 (2019).

図1 XmiRは、Fzd4 mRNAの発現を抑制し、WNT//βカテニン・シグナルを阻害することで、精原幹細胞の増殖を抑制し減数分裂を促進する働きがあると考えられる。

7　マウス初期奇形腫細胞由来の多能性幹細胞株の樹立

胎仔に存在する未分化な生殖細胞である始原生殖細胞(PGC)は、特定のサイトカイン等の存在下で培養すると、容易に多能性幹細胞株のEG細胞に再プログラム化されます。胎仔精巣内では、始原生殖細胞は通常は精子への分化に進みますが、Dnd1などの特定の遺伝子変異や遺伝的背景により、奇形腫（テラトーマ）細胞へ変化します。奇形腫は多能性細胞と、そこから分化したさまざまな組織細胞からなる腫瘍で、胎仔生殖細胞が、まず多能性幹細胞へ再プログラム化されることによりできると考えられます。私たちはこれまでの奇形腫形成に関する研究で、DND1の作用機構について報告しました。今回の研究では、Dnd1変異マウスの初期奇形腫細胞から多能性幹細胞株を樹立し、その性質を調べました。PGC由来のEG細胞は、ES細胞やiPS細胞と同様、着床前の胚に移植するとキメラマウスを形成し、高い分化能を持ちナイーブ型多能性幹細胞と呼ばれています。一方、着床後のエピブラストからも多能性幹細胞株（Epi幹細胞）ができますが、キメラ形成は起こすことができず、やや分化の進んだ多能性状態だと考えられ、プライム型多能性幹細胞と呼ばれています。Dnd1変異マウスの初期奇形腫細胞から樹立された多能性幹細胞株(CDGC)は、遺伝子発現パターンやキメラ形成能などから、ナイーブ型とプライム型の中間的な性質を持つ多能性幹細胞であることが示唆されました。 PGCが培養下で直接的に再プログラム化されると、ナイーブ型多能性幹細胞になりますが、胎仔内で精子を形成する細胞へと分化しながら再プログラム化されると、プライム型になると考えられ、異なる分化状態の生殖細胞が、違う性質を持つ多能性幹細胞細胞に再プログラム化されることがわかりました。
An, Y., Sekinaka, T., Tando, Y., Okamura, D., Tanaka, K., Ito-Matsuoka, Y., Takehara, A., Mochizuki, K., Yaegashi, N., Matsui, Y. Derivation of pluripotent stem cells from nascent undifferentiated teratoma. Developmental Biology 446, 43-55 (2019).

図1 PGCが培養下で直接、再プログラム化されるとナイーブ型多能性幹細胞になるが、胎仔内で精子形成細胞へと分化する過程で再プログラム化されると、プライム型多能性幹細胞になる。

8　生殖細胞形成の初期段階で、ヒストンメチル化酵素SETDB1がBMPシグナル関連遺伝子の発現を制御する

生殖細胞は次世代個体の形成を担う唯一の細胞で、命が世代間で受け継がれるために必須な役割を果たします。哺乳動物の生殖細胞は、胚発生の初期段階の着床直後に始原生殖細胞（PGC）として形成されます。そしてこれまでの研究で、PGC形成に必要ないくつかの分子が同定されていますが、詳しい制御機構はよくわかっていませんでした。そこでPGC形成を制御する遺伝子のスクリーニングを行い、これまでにヒストン脱アセチル化酵素HDAC3が、体細胞の初期分化に関わる体細胞遺伝子の発現を抑制することがPGC形成に必要であることを報告しました。さらに今回、このスクリーニングで同定したもう一つの因子であるSETDB1のPGC形成における作用機構を解明しました。まずSETDB1の機能欠損によりPGC形成が阻害されることを明らかにしました。さらにSETDB1がヒストンH3のリジン9のメチル化を介して転写因子UTF1、OTX2、DPPA2の遺伝子発現を抑制するこがわかりました。そして、PGC形成の初期段階で働くBMPシグナルに関係する遺伝子の発現を、転写因子UTF1等が抑制することを見いだしました。つまりSETDB1がUTF1などの発現抑制を介して、BMPシグナル遺伝子の発現を保障していることが明らかになりました。これらの研究成果により、PGC形成過程では、段階的なエピジェネティック制御が働いていることがわかりました（図2）。まずSETDB1が遺伝子のヒストンメチル化によりBMPシグナル関連遺伝子の発現を制御して、BLIMP1等の転写因子の発現を導きます。さらに先に報告したHDAC3が遺伝子のヒストン脱アセチル化を介して、BLIMP1とともに、体細胞遺伝子の発現を抑制することでPGCへの分化が進行すると考えられます。
Mochizuki, K., Tando, Y., Sekinaka, T., Otsuka, K., Hayashi, Y., Kobayashi, H., Kamio, A., Ito-Matsuoka, Y., Takehara, A., Kono, T., Osumi, N., Matsui, Y. SETDB1 is essential for mouse primordial germ cell fate determination by ensuring BMP signaling. Development 145, dev164160, 2018.

図1　SETDB1とHDAC3によるPGC形成の制御

SETDB1がヒストンメチル化によりBMPシグナル関連遺伝子の発現を保障する。さらにHDAC3がヒストン脱アセチル化により、体細胞遺伝子の発現を抑制することでPGCへの分化が起こる。

9　多能性幹細胞で生殖細胞遺伝子の発現を抑制するエピジェネティック機構

　胚発生の初期段階で、多能性幹細胞の一部から精子か卵子のみに分化する始原生殖細胞が発生します。始原生殖細胞と多能性幹細胞は一部の遺伝子発現が類似していますが、始原生殖細胞特異的な遺伝子は、多能性幹細胞では発現抑制されています。私たちのこれまでの研究で、転写制御因子MAXが多能性幹細胞株ES細胞で、生殖細胞特異的遺伝子の発現を、ヒストンH3K9ジメチル化酵素G9A, GFPと共に、ゲノムワイドに抑制していることを示しました(Nature Commun.4,1754,2013)。またMAXは、ポリコーム複合体PRC1.6の構成因子として働くことが報告されています。今回の研究では、MAXがPRC1.6とは別に、DNAメチル化酵素DNMTsおよびヒストンH3K9トリメチル化酵素SETDB1とも相互作用し、生殖細胞特異的遺伝子の発現を抑制していることを明らかにしました。この結果から、MAXを軸とした多様なエピジェネティック機構が、多能性幹細胞が生殖細胞の性質を獲得することを抑制していると考えられます。

図1　MAXを含む複合体による、生殖細胞特異的遺伝子発現の抑制

Tatsumi, D., Hayashi, Y., Endo, M., Kobayashi, H., Yoshioka, T., Kiso, K., Kanno, S., Nakai, Y., Maeda, I., Mochizuki, K., Tachibana, M., Koseki, H., Okuda, A., Yasui, A., Kono, K., and Matsui, Y. DNMTs and SETDB1 function as co-repressors in MAX-mediated repression of germ cell–related genes in mouse embryonic stem cells. PLoS ONE 13, e0205969 (2018).

10　始原生殖細胞の多能性幹細胞への再プログラム化を促進する因子の同定

始原生殖細胞は多能性幹細胞から分化しますが、通常その分化は精子または卵子に向かって一方向に進み、他の種類の細胞への分化や、分化を後戻りすることはありません。しかし私たちのこれまでの研究から、いくつかの増殖因子とともに培養すると、一部の始原生殖細胞が1週間ほどで多能性幹細胞であるEG細胞へ再プログラム化されることが明らかになっています。この再プログラム化の分子経路を解明する目的で、再プログラム化の効率に影響する遺伝子の同定を試みました。まずPGCと多能性幹細胞であるES細胞のトランスクリプトーム比較により、両者で発現差の大きい転写因子またはエピジェネティック制御因子遺伝子を選択しました。次のそれらの遺伝子をPGCで過剰発現またはノックダウンし、EG細胞の形成効率の変化を調べました。その結果、BCL3とKLF9の過剰発現によりEG細胞形成が促進されることがわかりました。特にKLF９は、EG形成に必要なサイトカインであるbFGFの下流にあり、またKLF9の下流には、やはりEG細胞形成に関与するcAMPシグナルがあることが示唆されました。この研究により、PGCの再プログラム化を制御する新たな分子経路の一端が明らかになりました。

図1 　Klf9の過剰発現(OE)により、EG細胞コロニー数が増加する（左）。KLF9は、bFGFの下流、cAMPシグナルの上流で、PGC再プログラム化を制御していると考えられる（右）。

Otsuka, K., Takehara, A., Chiba, N., Matsui, Y. Identification of KLF9 and BCL3 as transcription factors that enhance reprogramming of primordial germ cells. PLoS ONE 13, e0205004 (2018).

大学院の紹介

私たちの研究室は、大学院生命科学研究科分化再生制御分野、および医学系研究科の講座にもなっていて、大学院生として研究に参加できます。

研究内容

具体的には次に挙げるようなテーマで研究を行っています。

1 妊娠期の化学物質摂取が子孫の精子形成異常を引き起こすしくみ

2 卵母細胞の発育におけるピルビン酸のミトコンドリアへの取込の役割

3 胎仔期生殖細胞の雌雄と発生段階に特徴的な代謝状態の変化

4 精子とがん細胞の意外な接点‐がん・精巣抗原タンパク質TEKT5による精子形成とがん増殖の制御機構-

5 シグナル伝達分子AKTによる、細胞周期とエピジェネティック制御を介した、始原生殖細胞の再プログラム化機構

6 生殖細胞特異的なマイクロRNAによる精子形成の制御機構

7 マウス初期奇形腫細胞由来の多能性幹細胞株の樹立

8 生殖細胞形成の初期段階で、ヒストンメチル化酵素SETDB1がBMPシグナル関連遺伝子の発現を制御する

9 多能性幹細胞で生殖細胞遺伝子の発現を抑制するエピジェネティック機構

10 始原生殖細胞の多能性幹細胞への再プログラム化を促進する因子の同定