研究内容

生き物のからだを作っている全ての種類の細胞の元となり、さらに複雑な形態形成へと繋がる生殖細胞の不思議な能力が、どのようなメカニズムによって制御されているのかに興味を持って研究を進めています。

哺乳動物では胎仔(胚)発生の初期段階で、まず分化万能性をもつ多能性幹細胞が形成され、そこから生殖細胞を含む、さまざまな細胞が分化します。からだを構成する体細胞の場合には、分化後さまざまな機能を果たす細胞として役割を全うしたのち細胞死を起こしますが、生殖細胞だけは精子と卵子へ分化し、それらが受精することにより再び個体発生全能性を持つ受精卵に戻るという性質を持っています。生殖細胞が分化し、卵子や精子が形成される過程では、核の中の遺伝子の働き方の制御に深く関わっているエピジェネティックな状態が、体細胞では起こさないような変化をしていることが明らかになり、このような変化が生殖細胞の不思議な性質と深く関わっていると考えられています。

また細胞の分化は、普通は後戻りすることはありませんが、分化途中にある生殖細胞は、いくつかの増殖因子とともに培養すると、短時間で多能性幹細胞へ戻ることが明らかになっています。このことから生殖細胞と多能性幹細胞は性質が異なっていますが、容易に相互変換できる関係にあると考えられます。また生殖細胞以外の分化細胞でも、細胞分化多能性の鍵となる転写因子などを強制的に発現させることでiPS細胞へと変化することがわかっており、分化細胞が多能性幹細胞へ後戻りする再プログラム化のメカニズムには、共通した原理があるように思えます。

このような生殖細胞や多能性幹細胞に関係した研究によって、私たちのからだの成り立ちを最初にコントロールしている根本原理を解明し、またそれによって不妊や先天性異常の原因解明や治療、さらに再生医療に役立てたり、また有用な生き物や希少な生き物を増やしたり保存したりする新しいテクノロジーを作り出せるのではないかと考えています。

図1 生殖細胞と多能性幹細胞の関係

生殖細胞と多能性幹細胞の関係

具体的には次に挙げるようなテーマで研究を行っています。

胚には未分化な生殖細胞として始原生殖細胞が存在しています。この始原生殖細胞は胚が子宮に着床してまもない時期に、多能性幹細胞集団の一部から分化運命決定を受け現れます。その後、始原生殖細胞は一部が細胞死を起こしながら活発に増殖し、やがて減数分裂を経て精子または卵子へと成熟していきます。

私たちはこれまでに、1)多能性幹細胞株であるES細胞を、生殖細胞へ直接的に変化させるスイッチ機構を解明しました。また、2)始原生殖細胞の分化過程で逐次的に起こる特異的な遺伝子発現に関わるエピジェネティック制御機構を見いだしました。さらに、3)胚から取ってきた始原生殖細胞を材料として遺伝子クローニングを行い、始原生殖細胞の増殖や生存の鍵となる遺伝子の単離に成功し、その作用機構を明らかにしました。一方、4)始原生殖細胞が多能性幹細胞へ再プログラム化されるメカニズムの一端を明らかにしました。その内容を以下に説明します。

また、これらの研究に加えて、現在は、始原生殖細胞形成の分子機構、多能性幹細胞でのエピジェネティックな遺伝子発現制御機構、エピジェネティックな操作などにより、体細胞を直接、生殖細胞へ変換させる試み、がんと生殖細胞の接点を探る研究なども進めています。


1 始原生殖細胞のユニークな細胞内代謝状態とその役割

細胞の代謝状態は、細胞機能の制御に重要と考えられますが、生殖細胞の代謝状態が分化の過程で、どのように変化し、それが生殖細胞の性質にどのような影響を与えるかは分かっていませんでした。わたしたちは、これらを次のような実験により明らかにしました。

まず生殖細胞特異的に緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用い、GFP陽性の生殖細胞とGFP陰性の生殖巣体細胞を精製しました。次にそれらを使った網羅的な代謝化合物解析(メタボローム解析)、タンパク質解析(プロテオーム解析)を行い、生殖細胞では多能性幹細胞と比較して、アミノ酸と核酸の合成経路が亢進していること、さらに解糖系の抑制と、ミトコンドリアで効率よくエネルギーを産生する酸化的リン酸化の亢進が起こっていることを見出しました。また胎仔生殖巣の体細胞と比較しても、酸化的リン酸化が亢進していることがわかりました。

また様々な胎齢由来の胎仔生殖細胞のエネルギー代謝活性を測定し、胚発生の進行に伴う生殖細胞の分化過程で、解糖系活性の低下と、酸化的リン酸化活性の上昇が、逐次的に起こることがわかりました。さらに培養系に阻害剤を添加することで酸化的リン酸化を阻害すると、生殖細胞の形成と生存が顕著に抑制されることを明らかにしました。また同様に解糖系を阻害した場合は、胎仔生殖細胞の多能性幹細胞への再プログラム化が阻害され、また生殖細胞の形成も影響を受けることがわかりました。

これらの研究成果から、胎仔生殖細胞では核酸とタンパク質の生合成が亢進している可能性が示唆され、さらにミトコンドリアのエネルギー産生経路が生殖細胞の形成と維持に必須であることが明らかになり、こういった代謝の特徴が、次世代個体を担う精子・卵子に分化する上で重要な役割を果たしている可能性が示されました。今後、エネルギー代謝経路の変化に関わる遺伝子を同定し、その変異が引き起こす配偶子形成異常を調べることなどにより、生殖細胞における代謝異常と不妊や先天性異常との関連を解明することが期待できます。

Yohei Hayashi, Kei Otsuka, Masayuki Ebina, Kaori Igarashi, Asuka Takehara, Mitsuyo Matsumoto, Akio Kanai, Kazuhiko Igarashi, Tomoyoshi Soga, and Yasuhisa Matsui. Distinct requirements for energy metabolism in mouse primordial germ cells and their reprogramming to embryonic germ cells. Proceedings of National Academy of Science, USA. 114, 8286-8294 (2017) doi/10.1073/pnas.1620915114

図2 始原生殖細胞のエネルギー代謝活性の特徴
始原生殖細胞では、多能性幹細胞から分化する過程で、解糖系が抑制される一方で、酸化的リン酸化の活性化がおこる。こういったエネルギー代謝経路の変化が、始原生殖細胞の形成・生存・分化に重要であると考えられる。


2 DNAメチル化による、がん精巣抗原遺伝子Fthl17 の発現制御機構

 生殖細胞と、がん細胞で共通して発現が認められ、他の正常組織では発現が低い、がん精巣抗原(cancer/testis antigen; CTA)遺伝子の、生殖細胞と、がん細胞における発現制御機構の相違を明らかにする目的で、CTA遺伝子の1つ、Fthl17 (Ferritin, heavy chain like 17) に着目し、DNAメチル化を中心とした発現制御機構解析を行った。まずFthl17は、正常組織と比較して肺がん細胞では中程度の発現を、また精巣内で精子を形成する元となる精原幹(Germline stem; GS)細胞では高いレベルで発現していることを確認した。次にバイサルファイト・シークエンス法とメチル化レポーターアッセイにより、肺がん細胞、GS細胞では、ともに遺伝子上流領域のDNA低メチル化が発現誘導を引き起こしていることを明らかにした。さらに、これらの細胞では、転写開始点直近の隣り合った異なる領域のDNAメチル化状態に違いがあり、それぞれの細胞での発現レベルを制御している可能性が示唆された。

Aoki, N., Mochizuki, K., Matsui, Y. DNA Methylation of the Fthl17 5'-Upstream Region Regulates Differential Fthl17 Expression in Lung Cancer Cells and Germline Stem Cells. PLoS ONE 12, e0172219 (2017).

図3
正常組織と比較して、がん細胞では、遺伝子上流領域のの部分の低メチル化状態が中程度の発現を、また精原幹細胞ではの部分の低メチル化状態が高レベルの発現を引き起こすことがわかった。

3 体細胞を生殖細胞に近づける試み

生殖細胞は受精を経て次世代個体を生み出すという個体発生全能性をもっていますが、体細胞にそのような性質はありません。このような性質の違いがどのように生みだされるのか、また、どのように制御されているのかを明らかにするため、わたしたちは、培養下で体細胞から生殖細胞を直接誘導し、そのメカニズムを解明することを考えました。

体細胞から生殖細胞を直接誘導する戦略として、体細胞では発現しておらず生殖細胞で発現している、多能性関連遺伝子と生殖細胞特異的遺伝子を同時に発現誘導することを考えました。具体的には、多能性関連遺伝子の発現誘導には、山中4因子発現プラスミド(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)の導入を行いました。また生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導を行うために、生殖細胞では遺伝子の発現に対して促進的なエピゲノム状態が多く見られることに注目し、その状態に近づけるために、 干渉法によるDNAのメチル化酵素遺伝子の発現阻害と、低分子化合物によるH3K27 tri-methylation(H3K27me3)を含む複数の抑制的ヒストン修飾の阻害、および細胞分化を促進する働きのある因子である TGF-βの阻害を組み合わせる処理を行いました。その結果、発現レベルは低いながらマウス胎仔線維芽細胞(MEF)において、生殖細胞特異的遺伝子群を発現誘導することに成功しました。また体細胞性遺伝子の発現は誘導されていなかったことから、生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導は非特異的な転写活性化によるものではないと考えられます。一方、神経系特異的遺伝子など、いくつかの組織特異的遺伝子の発現誘導も、同時に見られることがわかりました。以上の結果は、 MEFでは生殖細胞特異的遺伝子を含む組織特異的遺伝子の発現は、DNAメチル化やヒストンH3K27me3を含むヒストン修飾などによるエピジェネティック制御を介して抑制されていることを示唆しています。

Sekinaka,T.,Hayashi, Y., Noce, T., Niwa, H., Matsui, Y. Selective de-repression of germ cell-specific genes in mouse embryonic fibroblasts in a permissive epigenetic environment. Scientific Reports6:32932 (2016). DOI: 10.1038/srep32932

図4 培養下で体細胞の遺伝子発現パターンを生殖細胞に近づける手法

抑制的ヒストン修飾などを阻害する低分子化合物とともに、DNAメチル化酵素の発現を低下させることのできるRNA干渉法を使って、マウス胎仔線維芽細胞を数日間、培養することより、遺伝子発現パターンを生殖細胞に近づけることに成功しました。赤色で示されている細胞が生殖細胞へ近づいた細胞(生殖細胞マーカーである Dazl陽性細胞)です。また、青色は細胞の核(DAPIによる染色)を示しています。

4 始原生殖細胞の多能性幹細胞への再プログラム化の制御機構

始原生殖細胞は多能性幹細胞から分化しますが、通常その分化は精子または卵子に向かって一方向に進み、他の種類の細胞への分化や、分化を後戻りすることはありません。しかし私たちのこれまでの研究から、いくつかの増殖因子とともに培養すると、一部の始原生殖細胞が1週間ほどで多能性幹細胞へ再プログラム化されることが明らかになっています。さらに細胞内情報伝達分子のAktを強く活性化すると、比較的早い発生段階である10.5日胚の始原生殖細胞では、その過半数が多能性幹細胞へ変化することを見出しました。この結果から、始原生殖細胞と多能性幹細胞は密接に関連していて、情報伝達系の活性化のみで容易に多能性幹細胞へ変化するポテンシャルを持っていることがわかりました。 (Matsui, Y. et al. The majority of early primordial germ cells acquire pluripotency by Akt activation. Development 141, 4457-4467, 2014)

図5 Aktの活性化により始原生殖細胞から樹立された多能性幹細胞(左)では、未分化細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼが発現している(中、赤い染色)。またこの細胞を胚盤胞に移植するとキメラ形成に寄与する(右)。

5 多能性幹細胞を始原生殖細胞へ直接変換させる分子機構

多能性幹細胞は、通常は外胚葉性の細胞に変化したのち、そのごく一部が始原生殖細胞に分化しますが、生殖細胞と多能性幹細胞は共通した遺伝子発現などの性質を共有し、直接的に生殖細胞へ変化する可能性が考えられます。

私たちは、未分化状態で維持されているES細胞で、転写制御因子Maxの発現を低下させると、生殖細胞特異的遺伝子の発現が全ゲノム的に上昇することを見いだしました。またMaxはES細胞においてヒストンH3K9メチル化酵素のG9a, GLPと複合体を作り、さらに生殖細胞特異的遺伝子のプロモーター領域に結合することで、H3K9メチル化を介してそれら遺伝子の発現を抑制することがわかりました。この結果から、多能性幹細胞ではH3K9のメチル化が、始原生殖細胞へ変化することを押しとどめているバリアとして働いていて、このバリアが解除されることが、多能性幹細胞が始原生殖細胞へ変化するためのスイッチの一つとして働いている可能性が考えられます。

図6 Maxのノックダウンにより始原生殖細胞特異的遺伝子を発現するようになったES細胞。緑が始原生殖細胞特異的なVasa-Venusレポーター遺伝子の発現を示す。また赤はH3K9のメチル化を示し、Vasa-Venus陽性細胞では低メチル化になっていることがわかる。青は細胞核を示す。

(Maeda et al., Max is a repressor of germ-cell-related gene expression in mouse embryonic stem cells. Nature Communications 4,1754, 2013, doi: 10.1038/ncomms2780.)




大学院の紹介

私たちの研究室は、大学院生命科学研究科分化再生制御分野(http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/research/celldifferentiation/)、および医学系研究科の講座(http://www.med.tohoku.ac.jp/org/cooperate/127/index.html)にもなっていて、大学院生として研究に参加できます。


最近の発表論文

  1. Hayashi, Y., Otsuka, K., Ebina, M., Igarashi, K., Takehara, A., Matsumoto, M., Kanai, A., Igarashi, K., Soga, T., Matsui, Y.Distinct requirements for energy metabolism in mouse primordial germ cells and their reprogramming to embryonic germ cells. Proc Natl Acad Sci USA., 114, 8286-8294,(2017). doi/10.1073/pnas.1620915114 PMID:28716939
  2. Aoki, N., Mochizuki, K., Matsui, Y. DNA Methylation of the Fthl175'-Upstream Region Regulates Differential Fthl17 Expression in Lung Cancer Cells and Germline Stem Cells. PLoS ONE 12, e0172219 (2017). PMID: 28207785
  3. Sekinaka, T., Hayashi, Y., Noce, T., Niwa, H. and Matsui, Y. Selective de-repression of germ cell-specific genes in mouse embryonic fibroblasts in a permissive epigenetic environment. Sci. Rep., 6, Article number:32932 (2016). PMID: 27608931
  4. Matsui, Y., Takehara, A., Tokitake, Y., Ikeda, M., Obara, Y., Morita-Fujimura,Y., Kimura, T., and Nakano, T. The majority of early primordial germ cells acquire pluripotency by Akt activation. Development 141, 4457-4467 (2014). PMID: 25359722
  5. Leitch, H.G., Okamura, D., Durcova-Hills, G., Stewart, C.L., Gardner, R.L., Matsui, Y., Papaioannou, V.E. On the fate of primordial germ cells injected into early mouse embryos. Developmental Biology 385, 155-159 (2014). PMID: 24269765
  6. Matsui, Y. and Mochizuki, K. A current view of the epigenome in mouse primordial germ cells. Molecular Reproduction and Development 81, 160-170 (2014). PMID: 23868517
  7. Maeda, I., Okamura, D., Tokitake, Y., Ikeda, M, Kawaguchi, H., Mise, N., Abe, K., Noce, T., Okuda, A, Matsui, Y. Max is a repressor of germ-cell-related gene expression in mouse embryonic stem cells. Nature Communications 4, 1754 (2013). PMID: 23612295
  8. Okamura, D., Maeda, I., Taniguchi, H., Tokitake, Y., Ikeda, M., Ozato, K., Mise, N., Abe, K., Noce, T., Izpisua Belmonte, J. C. and Matsui, Y. Cell-cycle gene-specific control of transcription has a critical role in proliferation of primordial germ cells. Genes & Development 26, 2477-2482 (2012). PMID: 23154982
  9. Okamura, D., Mochizuki, K., Taniguchi, H., Tokitake, Y., Ikeda, M., Yamada, Y., Tournier, C., Yamaguchi, S., Tada, T., Scholer, H.R. and Matsui, Y. REST and its downstream molecule Mek5 regulate survival of primordial germ cells. Developmental Biology 372, 190-202 (2012). PMID: 23022299
  10. Flachs, P., Mihola, O., Šimeček, P., Gregorová, S., Schimenti, J.C., Matsui, Y., Baudat, F., de Massy, B, Piálek, J., Forejt, J, and Trachtulec, Z. Interallelic and Intergenic Incompatibilities of the Prdm9 (Hst1) Gene in Mouse Hybrid Sterility. PLoS Genetics 8, e1003044 (2012). PMID: 23133405
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